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다양한 온도에서 반응할 수 있는 Capping enzyme

Faustovirus Capping Enzyme (S17)

제조사	제품코드	제품명	용량	가격 (부가세별도)	비고	사용자매뉴얼
Takara	2480A	Faustovirus Capping Enzyme (S17)	500 U	160,000원
Takara	2480B	Faustovirus Capping Enzyme (S17)	2,000 U (2480Ax4)	576,000원

Product index

in vitro transcription

제품설명

Faustovirus Capping Enzyme (S17) (;FCE)은 Faustovirus S17균주 유래의 효소로 단일 subunit을 가진 단백질이다. 이 효소는 기존에 사용되던 vaccinia 바이러스 유래의 Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A) (;VCE)과 유사한 작용 기전을 가지고 있어 RNA (5'-triphosphate RNA)의 5’ 말단에 7-methylguanylate cap 구조 (Cap 0)를 부가하는 활성을 가진다. 이 효소를 사용하면 IVT에서 효과적으로 완전한 Cap 0 구조를 가지는 RNA를 합성할 수 있고 여기에 mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)를 같이 사용하면 Cap 0의 구조 RNA에서 첫번째 뉴클레오타이드의 2’-O 부분을 메틸화하여 Cap 1의 구조의 RNA를 single step으로 합성하는 것 역시 가능하다*.

Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)보다 다양한 온도에서 높은 활성을 보이고 (30~50℃) (그림 1), 다양한 RNA에 적용 가능하기 때문에 mRNA 백신 및 치료제 등 분야의 연구 개발에 유용하다.

*Uncapped RNA를 1 step으로 Cap-1 RNA로 합성하고자 하는 경우, mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)에 포함된 버퍼 대신 Faustovirus Capping Enzyme에 포함된 10×Capping Buffer 2 를 사용하세요.

그림 1. 반응온도에 따른 FCE와 VCE의 capping 효율
FCE와 VCE 두 종류의 capping enzyme을 사용해 다양한 온도에서 capping 반응을 진행하고 LC/MS로 capping 효율을 (Cap 0 비율)을 측정했다. 그 결과 FCE가 VCE보다 넓은 온도 범위에서 높은 capping 효율을 보였다.

용도

- Cap 0 구조를 갖는 mRNA 합성
- mRNA Cap 2-O-Methyltransferase와 병용하여 Cap 1 구조를 갖는 mRNA 합성

내용

구성품	용량
Faustovirus Capping Enzyme (S17) (25 U/μl)	500 U
10×Capping Buffer 2	100 ㎕
S-adenosylmethionine (SAM) (32 mM)	100 ㎕
GTP (10 mM)	50 ㎕

보존: -20 ℃

농도: 25 U/㎕

기원

Escherichia coli carrying a plasmid containing the gene for Faustovirus capping enzyme (S17)

일반적인 성질

- 분자량: 약 100 kDa

활성의 정의

37 ℃에서 30분 동안 5 pmol의 100 nt 전사체를 Cap 0 RNA로 전환시키는 효소의 양을 1U으로 한다.

활성 측정용 반응액의 조성

1 x		Capping Buffer 2
25 ㎕		GTP
20 μCi/㎖		[3H]SAM
2.5 ㎍/50 ㎕		100 nt RNA

사용 예

1. Uncapped RNA (5’-triphosphate RNA)에서 Cap 0/Cap 1 RNA 합성 [2 step reaction]

RNA transcript (50 ㎍)^*1		38 ㎕
10x Capping Buffer 2		5 ㎕
GTP (10 mM)		2.5 ㎕
SAM (2 mM, dilute 32 mM stock to 2 mM)^*2		2.5 ㎕
Faustovirus Capping Enzyme (S17)^*3		2 ㎕
Total		50 ㎕ ^*4

37℃에서 30분 incubation^*3
이어서 mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)로 Cap 1 RNA 합성 가능

2. Uncapped RNA (5’-triphosphate RNA)에서 Cap 1 RNA 합성 [1 step reaction]

RNA transcript (50 ㎍)^*1		34 ㎕
10x Capping Buffer 2		5 ㎕
GTP (10 mM)		2.5 ㎕
SAM (4 mM, dilute 32 mM stock to 4 mM)^*2		2.5 ㎕
Faustovirus Capping Enzyme (S17)^*3		2 ㎕
mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase (50 U/㎕)^*3		4 ㎕
Total		50 ㎕ ^*4

37℃에서 30분 incubation^*3

^*1 RNA (5’-triphosphate RNA)의 5’말단이 복잡한 2차 구조를 가진 경우 반응 전 열로 변성시키는 것으로 capping 효율이 높아질 수 있다.
<열 변성>
(1) 정제된 RNA 50 ㎍을 RNase free water로 38 ㎕ (Cap 0 RNA 합성) 혹은 34 ㎕ (Cap 1 RNA 합성)로 희석한다.
(2) 65℃에서 5~10분 열변성 후 5분동안 얼음에서 incubation한다.
^*2 SAM은 불안정한 물질이기 때문에 반응 전 필요한 양을 미리32mM stock solution에서 RNase free water로 희석하여 사용한다. 희석된 시약은 반응 전까지 얼음 위에서 보관한다.
^*3 RNA의 capping 효율이 낮은 경우 효소의 사용량을 늘리거나 반응 시간을 늘린다.
^*4 반응액의 부피는 필요에 따라 스케일업 가능하다.
^*5 mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)에 포함된 버퍼가 아니라 Faustovirus Capping Enzyme (S17)에 최적화된 버퍼 (10×Capping Buffer 2)를 사용해야 한다.

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