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in vitro transcription에 의한 sgRNA 제작 및 효율 스크리닝

sgRNA 합성과 스크리닝

제조사	제품코드	제품명	용량	가격 (부가세별도)
Clontech	632635	Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit	50회 (Package)	1,445,000원
Clontech	632636	Guide-it™ Complete sgRNA Screening System	50회 (Package)	1,778,000원
Clontech	632639	Guide-it™ sgRNA Screening Kit	50회	530,000원
Clontech	632638	Guide-it™ IVT RNA Clean-Up Kit	50회	815,000원

Product index

Overivew
유전자 편집 전 단계
편집 유전자 도입
유전자 편집 후 확인
CRE recombinase
- CRE Recombinase Gesicl..
- AAV Helper Free System..

CRISPR/Cas9 genome editing을 위한 sgRNA의 합성 (in vitro transcription)
간편한 프로토콜로 고품질, 고수율 (12ug 이상)의 sgRNA 제작 가능
합성한 sgRNA는 추후 delivery (transfection, electroporation)에 이용 가능
Screening Kit에 포함되어있는 Cas9 단백질과 조합하여, 실제 세포 실험 전에 sgRNA의 유효성 및 효율 확인 가능 (sgRNA screening)

제품설명

Guide-it™ sgRNA In vitro Transcription Kit (Code 632635)는 in vitro transcription 반응으로 간편하게 12ug 이상의 고품질, 고수율의 sgRNA를 제작할 수 있다. 본 제품 내에는 Phenol/Chloroform 방식이 아닌 스핀 컬럼 방식의 RNA 정제 키트인 Guide-it™ IVT RNA Clean-Up Kit (Code 632638)가 포함되어있다. 정제한 sgRNA는 그대로 transfection, electroporation 또는 in vitro cleavage assay에 적용할 수 있다.
Guide-it™ Complete sgRNA Screening System (Code 632636)은 Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code 632635)와 Guide-it™ sgRNA Screening Kit (Code 632639) 제품으로 구성되어있다. 본 제품을 사용하여 in vitro transcription으로 합성한 sgRNA와 제품 내 포함된 Cas9 재조합 단백질을 실험 튜브 내에서 반응시킴으로써, 실제 세포 실험 전에 in vitro cleave assay를 통하여 sgRNA의 유효성 및 절단 효율을 확인 가능하다. 본 제품 이용 시, sgRNA의 절단부위를 포함한 DNA는 PCR 증폭 후, 재조합 Cas9 nuclease로 절단을 하며, 이 절단 효율은 agarose gel eletrophoresis로 확인할 수 있다.

기존 제품과의 차이점

본 제품은 기존 제품과 제품명은 같지만, 버전 업그레이드 출시되었으며 아래와 같이 변경되었다.

Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit

용량: 10회 → 50회로 변경
프로모터 및 scaffold 서열 변형으로 sgRNA 합성 수율 3배 이상 향상(12ug 이상) 및 genome editing 효율 향상
Forward primer 서열 변경: T7 promoter와 scaffold 서열 변형으로 Primer 총 길이가 69nt → 56-58nt로 변경

[기존]- total length 69nt

[신규]- total length 56-58nt

Template DNA(sgRNA encoding template)의 PCR 증폭을 위하여 PrimeSTAR® Max DNA Polymerase를 적용하여 비특이적 증폭 감소, Agarose gel purification 방법 불필요
Phenol/Chloroform 정제 대신 스핀 컬럼 방식의 RNA Clean-Up Kit으로 RNA 정제

Guide-it™ sgRNA Screening Kit

용량: 30회 → 50회로 변경
Target DNA(DNA cleavage template)의 조제에 Terra PCR Mix을 이용하여 Direct PCR 가능

상세내용 및 데이터

그림 1. Flow chart describing how the Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit (including the Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit) and Guide-it sgRNA Screening Kit work together in the Guide-it Complete sgRNA Screening System, which can be used to synthesize and test the efficacy of sgRNAs.

그림 2. Schematic highlighting the key steps for using Guide-it kits for the production of high amounts of single guide RNA (sgRNA) and screening for cleavage efficacy at the desired target site using recombinant Cas9 protein.

그림 3. RNA quality produced via in vitro transcription. sgRNAs produced using the Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit were compared with sgRNAs produced using a competitor’s kit. The Guide-it kit produced a high-quality, single band for each reaction, while the competitor’s kit showed unwanted byproducts.

그림 4. sgRNA yield and quality for different gene targets using the Guide-it Complete sgRNA Screening System. Panel A. 20 μl of each sgRNA in vitro transcription (IVT) reaction was incubated for 4 hr at 37°C. The yield for each transcribed sgRNA was quantified using a NanoDrop spectrophotometer. Panel B. Each sgRNA IVT reaction was a run on an Agilent Bioanalyzer to assay for sample quality.

보존

Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Components v2: -20℃
Guide-it™ IVT RNA Clean-Up Kit: 실온
Guide-it™ sgRNA Screening Kit: -20℃

구성품 (자세한 내용은 CoA를 참조하세요)

Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code 632635; 50회)

1 each Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Components v2

50 μl Guide-it Scaffold Template (1 ng/μl)
350 μl Guide-it In Vitro Transcription Buffer
1 ml RNase Free Water
150 μl Guide-it T7 Polymerase Mix (33 U/μl)
625 μl PrimeSTAR Max Premix (2X)
100 μl Recombinant DNase I (RNase-Free) (5 U/μl)

1 each Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit (Code. 632638; 50 rxns)

13 ml RNase Free Water
3 ml IVT Binding Buffer
50 IVT RNA Clean-Up Spin Columns
2 x 6 ml IVT Wash Buffer
50 Collection Tubes (2 ml)

Guide-it™ IVT RNA Clean-Up Kit(Code 632638; 50회)

13 ml RNase Free Water
3 ml IVT Binding Buffer
50 IVT RNA Clean-Up Spin Columns
2 x 6 ml IVT Wash Buffer
50 Collection Tubes (2 ml)

Guide-it™ sgRNA Screening Kit (Code 632639; 50회)

25 μl Guide-it Recombinant Cas9 Nuclease (500 ng/μl)
50 μl 15X Cas9 Reaction Buffer
50 μl 15X BSA
5 μl Control sgRNA (50 ng/μl)
25 μl Control Fragment (20 ng/μl)
50 μl Terra PCR Direct Polymerase Mix (1.25 U/μl)
1.25 ml 2X Terra PCR Direct Buffer (with Mg²⁺, dNTP)
5 ml RNase Free Water
5 ml Extraction Buffer 1
0.5 ml Extraction Buffer 2

Guide-it™ Complete sgRNA Screening System (Code 632636) 제품은 Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code 632635)와 Guide-it™ sgRNA Screening Kit (Code 632639)를 포함하고 있습니다.

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