Dye-based (TB Green®) Real Time PCR Premix, 실험에 따라 선택하세요!
Introduction
Real Time PCR (Quantitative PCR; qPCR)은 유전자발현의 정교한 분석을 위해 일반적으로 널리 사용되는 분자생물학적 기법이다. 다카라에서 판매하고 있는 Dye-based Real Time PCR kit는 다카라의 독자적인 TB Green
® intercalating dye를 사용하여 고감도로 유전자 발현을 검출할 수 있다.
Intercalating dye-based qPCR은 PCR 증폭과정 중에 생성되는 이중가닥의 DNA에 intercalating dye가 결합하는 원리를 이용한다.
일반적으로 Dye-based qPCR은 많은 수의 샘플에서 빠르고 간단하게 유전자 발현을 분석하는 경우 적합하며, 라벨되지 않은 일반적인 oligonucleotide를 PCR 증폭에 사용하므로, 상대적으로 저렴하게 실험할 수 있다.
RNA를 이용하여 하나의 튜브에서 역전사반응을 마친 후, 튜브를 옮겨 qPCR 반응을 진행하는 Two-step Real Time RT-PCR (또는 two-step RT-qPCR)과 하나의 튜브에서 역전사반응과 qPCR 반응을 연속적으로 진행하는 One-step Real Time RT-PCR (또는 one-step RT-qPCR)에 맞는 다양한 dye-based Real Time PCR 시약을 선택할 수 있다.
Dye-based qPCR의 장점
- Rapid and simple protocol
- More cost-effective than probes
- Sensitive: 1,000X detection
Principles of green intercalating dye-based qPCR
Intercalating dye를 이용한 형광검출
본 Real Time PCR 법은 이중가닥의 DNA에 결합했을 때 형광을 나타내는 DNA intercalator (예, TB Green
®)을 사용한다. 형광량을 모니터링하여 증폭산물을 정량할 수 있다 (그림 1). 증폭이 완료된 후,
melting curve 분석을 통해 PCR 증폭산물이 특이적으로 증폭되었는지 확인할 수 있다. Takara 제품은 반응특이성과 감도를 극대화하기 위해 hot start version의
TaKaRa Ex Taq™ DNA polymerase를
사용하며, 이를 통해 반응 mixture 준비시간 또는 본 사이클 과정 전에 mispriming 또는 primer-dimer의 형성으로 발생할 수 있는 비특이적인 증폭을 최소화하였다.
그림 1. Dye-based qPCR 원리
Dye-based Real Time PCR 제품
Takara qPCR premix에는 내열성 Tli RNase H가 포함되어 있어 RNA에서 cDNA로 역전사한 후, cDNA에 결합되어 있는 RNA를 선택적으로 제거하여 cDNA에 PCR primer가 효율적으로 결합할 수 있도록 도와준다.
그림 2. 내열성 Tli RNase H 가 포함되어 정확한 정량 가능
일반적인 샘플 적용
TB Green® qPCR의 정석
TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) (Code RR820A)
신장속도 10초 고속 qPCR
TB Green® Fast qPCR Mix (Code RR430A)
증폭효율 No.1
TB Green® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus) (Code RR420A)
특수 샘플 적용
비특이적인 증폭, Primer dimer가 나타날 때
TB Green® Premix DimerEraser™ (Perfect Real Time) (Code RR091A)
gDNA, GC rich 서열 증폭에 최적
TB Green® Premix Ex Taq™ GC (Perfect Real Time) (Code RR071A)
Crude 샘플이나 GC 함량이 70% 넘는 샘플에 최적
MightyAmp™ for Real Time (TB Green® Plus) (Code R075A)
TB Green® Real Time PCR Premix 제품라인
*50 ㎕ 반응 시
Citations
RR820A: Chen, Q., Gu, Y. & Liu, B. Expression and mechanism of action of the SARI tumor suppressor in prostate cancer.
Int. J. Clin. Exp. Pathol.
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J. Biol. Chem.
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PLoS One 11, e0153156 (2016).
