Wild type의 Lentivirus는 양 말단의 LTRs을 포함하여 약 9.6 kb의 게놈을 가집니다. 클로닝으로 구축된 게놈 사이즈가 이보다 크다면 virus particle이 불안정해져 viral titer를 저하시킵니다.
Lenti-X system과 같은 재조합 lentivirus는 불필요한 viral 게놈을 제거하고 selection marker나, 형광단백질 유전자로 대체, 조작되어 있으며 목적유전자(GOI) 삽입을 위한 충분한 용량(size capacity)을 확보하고 있습니다.
각 pLVX vector는 각기 다른 기능을 가진 유전자를 포함하고 있기 때문에 삽입 가능한 유전자의 크기는 다릅니다. pLVX vector에 삽입 가능한 유전자 최대 크기는 각 제품의 vector map을 확인하여 계산 가능하며, Lentivirus 게놈 사이즈인 9.7 kb에서 벡터의 3’ LTR 위치를 뺀 값이 삽입 가능한 최대 유전자의 길이입니다 (5’ LTR은 항상 벡터의 시작지점을 의미합니다).

<예시>

• pLVX-Puro vector (Code 632164)의 3' LTR은 5.4 kb에 위치. 그러므로 4.3 kb의 유전자를 삽입 가능 (9.7 kb - 5.4 kb = 4.3 kb)
• pLVX-IRES-tdTomato (Code 631238)의 3' LTR은 6.3 kb에 위치. 약 3.4 kb의 유전자를 삽입 가능 (9.7 kb - 6.3 kb = 3.4 kb)

약 25%의 유사성을 가지고 있습니다. 예를 들어, pLVX-Puro vector는 wild-type HIV-1 게놈 (9,719 bp)과 비교하여 약 2,430 bp의 연속되는 유사 서열을 포함하고 있습니다.

아니오. Lentiviral vector 내의 3' LTR 부위에 전사종결인자가 존재하기 때문에 GOI 또는 selection marker의 gene expression cassette에는 poly(A) signal이나 그 어떠한 전사종결서열 (transcription termination signal)을 포함시켜서는 안 됩니다. 만약, Lentiviral construct의 중간에 전사종결서열이 포함이 된다면 viral genomic DNA의 불완전한 전사를 초래할 수 있으며, 이는 바이러스의 패키징 효율이나 유전자 도입 효율 저하의 원인이 됩니다.

형광단백질을 발현하는 IRES-Lentivirus vector의 경우, 적절한 삽입 유전자의 크기는 0.7 ~ 1.2 kb 이며, 2.5 kb 이상은 권장하지 않습니다.
하지만 항생제 내성 유전자를 발현하는 IRES-Lentivirus vector의 경우에는 2.5 kb 이상의 목적유전자 (GOI)를 삽입 가능합니다. 이는, 큰 사이즈의 GOI로 인해 항생제 내성유전자의 발현율이 낮아진다 하더라도 drug resistance 조건에서 충분히 생장할 수 있기 때문입니다.

Tip: GOI가 삽입되지 않은 “empty” IRES Lentivirus vector에서는 형광단백질발현 효율이 낮아집니다, 만약 목적 유전자를 삽입하지 않는다면, 0.5~1.2 kb의 stuffer sequence를 IRES의 업스트림 위치에 삽입하여 사용하는 것을 추천합니다.

네. Lentiviral 벡터를 일반 plasmid vector처럼 transfection 용도로 사용할 수 있습니다. 하지만 이는 lentiviral transduction의 장점을 기대할 수는 없습니다. Lentivirus로부터 생성된 proviral DNA가 5'-LTR, 3'-LTR을 이용하여 목적세포에 정확한 copy number로 삽입되는 것에 반하여, plasmid transfection의 경우 무작위로 쪼개어져 숙주세포의 게놈에 무작위 삽입되기 때문입니다.

HIV-1 기반의 Lentiviral vector는 대부분 다카라의 Lenti-X 패키징 시스템 (Lenti-X Packaging Single Shot (Code 631275 외))과 함께 사용할 수 있습니다.

Lenti-X Packaging Single Shot을 이용한 Lentiviral 패키징은 Lenti-X 293T Cell Line (Code 632180)과 293T cell에 최적화 되었습니다. HEK 293과 293FT에 사용할 경우 낮은 바이러스 titer을 보입니다


그림. Lenti-X 293T Cell Line을 사용하여 바이러스를 생산했을 때, 293FT Cell 대비 6배, HEK 293 Cell Line 대비 30배의 생산량을 보였다.

Lenti-X Packaging Single Shot (Code 631275 외) 제품은 하나의 튜브 내에 Lentiviral packaging vector mixture와 Xfect Transfection 시약이 혼합되어 있는 제품으로써, 하나의 튜브로 한번의 패키징 반응을 진행할 수 있습니다 (10 cm dish)

Lenti-X Packaging Single Shot (Code 631275 외)은 다카라의 4세대 Lentivirus Packaging System이 적용되어 고역가의 lentivirus를 간단하고 빠르게 제작하는 제품입니다. Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G) (Code 631275) 제품을 이용할 경우 107-108 IFU/㎖의 lentivirus 제작이 가능합니다.


그림. Consistent, high-efficiency transfections lead to high titers. A lentiviral vector containing the ZsGreen1 gene was packaged according to the Lenti-X™ Single Shots protocol in four independent experiments. Briefly, 7 μg of pLVX-ZsGreen1 plasmid was added to each of four Lenti-X™ Single Shots; the tubes were vortexed for 20 sec and incubated at room temperature for 10 min. Then, the mixture was added to cultured Lenti-X™ 293T cells that were approximately 80% confluent. Forty-eighty hours after transfection, the cells were imaged by fluorescence microscopy (Panel A, top) and light microscopy (Panel A, bottom). After images were taken, the supernatant was harvested and used infect HT1080 cells for titer determination (Panel B, IFU/ml).

Lenti-X Packaging Single Shot (Code 631275 외)은 4세대 lentiviral packaging 제품으로써, gag와 pol 유전자를 각각 다른 vector에 탑재하여 lentivirus의 자가복제를 방지하여 안전성을 높인 제품입니다.

4세대 버전의 Lentiviral Packaging Single Shot 시스템은 바이러스의 필수 유전자의 고발현을 위하여 transactivation-cascade를 적용하였습니다 (그림 1). Tet-Off transactivator는 모든 벡터의 TRE promoter로부터 gag-pro, tat-transactivator, rev 유전자를 발현시킵니다. 그 후, 발현된 tat transactivator는 다른 플라스미드에 위치한 pol 단백질의 발현을 유도합니다. 따라서 배양 시 사용하는 Serum 내에 tetracycline 또는 그 유사물질이 포함되어있는 경우, Tet-off transactivator protein의 구조의 변이를 유도하여 TRE promoter와의 결합을 억제할 가능성이 있습니다. 그 결과, 바이러스 필수 유전자의 발현에 영향을 주어 viral titer가 저하됩니다. 4세대 버전의 Lentiviral packaging system은 당사에서 판매 중인 Tet-Free FBS에 최적화 되어있습니다 (그림 2).

• Tet System Approved FBS, USDA-Approved (Code 631107)
• Tet System Approved FBS, US-Sourced (Code 631105)

그림 1. Lenti-X Packaging Single shots (4th generation) consists of 5 separate components (Panel A), mixed in proprietary proportions for optimized packaging activity. High levels of expression of essential viral components are driven by the Tet-Off and tat transactivators, resulting in high titers of virus. The pol gene is fused to vpr to ensure transport of the reverse transcriptase/integrase protein into the recombinant viral particle.

그림 2. Fetal bovine serum from Clontech is functionally tested to guarantee consistent results with tetracyclineinducible expression systems. Serum from other vendors that has not been functionally tested may contain tetracyclines that affect the maximum expression in Tet-Off Systems, or generate background in Tet-On Systems

예. Lenti-X concentrator를 Retrovirus에 적용하는 경우, Retro-X Concentrator 프로토콜과 같이 incubation time을 늘려서 농축할 수 있습니다. 자세한 프로토콜은 아래의 매뉴얼을 참고하십시오.

• Lenti-X Concentrator 매뉴얼
• Retro-X Concentrator 매뉴얼

MOI (multiplicity of infection)는 바이러스를 접종시킨 세포수에 대한 접종 바이러스 양의 비율로써, 접종 바이러스양/세포수. 즉, 세포 1개당 몇 개의 감염성 바이러스를 접종할 수 있는지에 대한 단위입니다.

IFU (infectious units)는 바이러스로 타겟세포를 감염시켜 삽입된 유전자에서 단백질을 발현할 수 있는 능력을 뜻합니다. Infectious viral titer (IFU/㎖) 를 측정하기 위해 reporter를 검출하거나 세포에서 발현된 단백질을 flowcytometry나 immunostatining 등을 통해서 확인합니다. 보다 정확하고 신속한 Titration 측정은 아래의 제품 사용을 권장합니다.

• Lenti-X qRT-PCR Titration Kit (Code 631235)
• Lenti-X p24 Rapid Titer Kit (Code 632200)
• Lenti-X Provirus Quantitation Kit (Code 631239)

CFU (colony forming unit)은 drug selection 과정에서 drug-resistance cell colonies를 카운팅한 수치입니다. 이는 Antibiotics resistance gene 또는 selection drug의 존재 하에서 생존할 수 있는 유전자를 가진 proviral DNA를 보유한 세포만 생존할 수 있기 때문에 바이러스의 세포 도입 능력 (ability to transduce cell)과 단백질 발현 능력 (ability to express protein)을 의미합니다.