분비형 his-tagged protein의 간단한 정제
Capturem™ His-Tagged Purification Maxiprep Kit
- 배양액에서 직접 분비형 활성 단백질을 정제
- 배양 상층액에서 쉽게 정제 - 프로토콜 개요 보기
■ Introduction
생물학적 활동에 필요한 post-translational modification이 진행되며 정확하게 folding 되고 조립된 충분한 양의 재조합 단백질을 발현하고 정제하는 것은 생물학적 분석의 주요 과제이다. 한 가지 가능성 높은 해결책은 이러한 단백질 분자를 포유동물 세포에서 분비형 단백질로 과발현하는 것인데, 이는 효모 또는 baculovirus 시스템보다 정확한 folding과 변형으로 활성 단백질을 생산하는 데 더 효과적이다 (Dalton and Barton 2014). 발현시킨 단백질이 세포 배양 배지로 분비되면 세포가 계속 성장함에 따라 배양 상층액을 교체해주면서 여러 번 단백질을 회수할 수 있으므로 많은 양의 단백질을 얻을 수 있다. 또한 세포를 용해하는 대신 배양 배지에서 단백질을 정제하면, 세포 안에 존재하는 단백질 분해효소에 대한 노출을 줄여 손상되지 않은 활성 단백질의 수율을 높일 수 있다.
기존의 재조합 his-tagged 단백질 정제 방법은 IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography) 컬럼이 필요하고, 컬럼을 로딩하기 전에 탈염 및 버퍼 교환 등 긴 절차와 수많은 컬럼 세척 과정이 필요하다.
반면,
Capturem™ His-Tagged Purification Maxiprep Kit는 새로운 고용량 멤브레인이 있는 maxi spin column을 사용하므로 이러한 번거로운 많은 과정을 생략할 수 있어, 간단히 15분 벤치탑 과정으로 2.5 ㎎의 his-tagged 단백질을 정제할 수 있다. 분비형 단백질을 포함하는 배지는 BSA 제거, 탈염 또는 버퍼 교환 없이 Capturem membrane에 직접 로드할 수 있다. Capturem 프로토콜에 사용되는 적은 elution 볼륨은 단백질을 고도로 농축시킬 수 있으므로, 대부분의 경우 원하는 버퍼에 희석할 수 있기 때문에 별도의 버퍼 교환이 불필요하다.
■ Results
Purification of active protein from culture supernatants
Capturem his-tagged 정제 시스템을 테스트하기 위해 bicistronic IRES vector를 사용하여 293T cell에서 분비 단백질 (6xhis-tagged Metridia luciferase)과 형광 transfection control (DsRed-Express2)을 같이 발현하고 Metridia luciferase 효소의 정제 전과 후 활성을 측정하였다. Metridia luciferase는 세포 내에서 유지되는 다른 luciferase와 달리 분비 단백질이기 때문에 테스트 샘플로 선택하였으며, 다른 luciferase와 마찬가지로 활성을 luminometer로 측정하기 쉬운 장점이 있다. 또한 동일한 RNA 전사체에서 두 개의 개별 유전자를 동시에 발현할 수 있는 bicistronic IRES vector를 사용하여, 형광 현미경 (그림, 패널 A)으로 DsRed-Express2 reporter를 확인하였고, 이를 통해 샘플 정제 전에 6xhis-tagged Metridia luciferase가 잘 발현되었는 지 확인할 수 있었다.
Transfection 48시간 후, 세포 배양 상층액을 원심분리하여 모든 debris를 제거한 후 Capturem His-Tagged Purification Maxiprep Kit를 사용하여 세포배양 상층액으로부터 his-tagged Metridia luciferase를 아래와 같이 정제하였다. Luciferase 활성을 정제 과정의 여러 단계에서 측정하였고 (그림, 패널B) 단백질이 효과적으로 농축된 것으로 나타났으며, 본 제품을 사용한 정제 조건이 luciferase 활성에 영향을 주지 않음을 확인하였다.
그림. Capturem™ His-Tagged Purification Maxiprep Kit를 사용하여 정제한 his-tagged Metridial luciferase의 높은 수율 및 활성
패널 A. 293T 세포에서 Metridia luciferase 발현 확인
6xhis-tagged Metridia luciferase와 적색 형광 리포터를 공동 발현하는 pEF1a-Metluc-6xHis-IRES2-DsRed-Express2 발현 벡터를 In-Fusion
® Cloning과 pEF1alpha-IRES-DsRed-Express2 Vector를 사용하여 제작하였고, Xfect Transfection 시약을 사용하여 293T 세포에 transfection 시켰다. 이후 DsRed-Express2 리포터를 사용하여 transfection 효율을 모니터링하였다.
패널 B. 정제 전과 후의 Metridia luciferase 수율 및 활성
His-tagged Metridia luciferase를 발현하는 293T 세포에서 얻은 배양 상층액을 이용한 정제 과정의 단계마다 luciferase 활성을 측정하였으며, 최종 elution한 샘플에서 높은 활성을 유지하고 있음을 확인하였다.
■ Conclusions
Capturem™ His-Tagged Purification Maxiprep Kit를 사용하면 15분 안에 BSA 제거, 탈염 또는 buffer 교환없이 세포 배양 상층액에서 활성을 가지는 분비형 6xhis-tagged 단백질을 정제할 수 있다. 기존 방법에는 많은 시간과 노력이 필요했지만 이제, Capturem™ His-Tagged Purification 시리즈를 이용하면 보다 쉽고 빠르게 단백질을 정제할 수 있다.
■ Method
Clarify 10 ml of cell culture supernatant (from a 10-cm dish) by centrifugation.
Equilibrate the column with 6 ml of xTractor Buffer.
Centrifuge the clarified sample through an equilibrated Capturem Maxiprep Nickel column.
Wash the column once with 6 ml of Wash Buffer.
Elute the secreted protein with 1 ml of Elution Buffer.
References
Dalton, A. C. & Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.
Protein Sci. 23, 517-525 (2014).
■ 관련제품
- His-tag 융합 단백질 정제 선택가이드
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