고순도 정제를 위한 Cobalt 기반의 TALON^® Metal Affinity Resin

TALON^® resin은 recombinant polyhistidine tag protein을 정제하도록 설계된 내구성이 뛰어난 cobalt 기반의 IMAC (immobilized metal affinity chromatography) resin이다 (Bush et al., 1991). 이 resin은 단백질 추출 시 일반적으로 사용되는 많은 시약과 호환되며 천연 (native) 및 변성 (denaturing) 조건에서 단백질 정제가 가능하다.
따라서 small scale의 단백질 발현 스크리닝, large scale의 단백질 발현 정제는 물론 gravity-flow/spin column, FPLC를 포함한 다양한 형태로 원핵 및 진핵 생물의 발현 시스템에 적용할 수 있다.

Introduction
단백질은 다양한 기능을 수행하기 위해 매우 복잡한 구조로 진화되어 왔다. 따라서 물리화학적 특성이 매우 다양하여, 일반적인 정제 프로토콜 적용이 어려운 경우가 있다.

 

현재 단백질의 일반적인 물리적 특성을 활용하는 정제 방법이 많이 개발되고 있으며, 그 중에서 단백질을 정제하는 가장 빠르고 쉬운 방법 중 하나가 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography)를 사용하는 것이다. 이 방법은 타겟 단백질을 한 두번의 과정만 거치면 간단하게 정제할 수 있다. 하지만 많은 단백질들은 그 특성이 아직 밝혀지지 않았거나, 정제에 사용 가능한 강력한 결합 특성이 알려져 있지 않다. 이러한 문제를 극복할 수 있는 한 가지 방법이 정제 tag을 타겟 단백질의 1차 아미노산 서열에 추가하여, 다양한 조건에서 정제할 수 있는 결합 부위를 가진 재조합 단백질을 구성하는 것이다.

IMAC 기술
TALON^® resin은 당사의 혁신적인 특허 기술을 기반으로 한 IMAC (immobilized metal affinity chromatography) resin이다.
IMAC는 1975년에 단백질을 분리하기 위한 group-specific affinity 기술로 도입되었다 (Porath et al., 1975). 다양한 아미노산 곁사슬 (side chains)과 고정화된 금속 이온이 가역적으로 상호 작용하는 원리로 고정화된 금속 이온에 따라 다른 종류의 곁사슬이 관여할 수 있다.
특히, 히스티딘 (histidine), 시스테인 (cysteine) 및 트립토판 (tryptophan) 곁사슬은 고정된 전이 금속 이온 및 아연과의 단백질 결합과 관련되어 있다 (Porath, 1985; Sulkowski, 1985; Hemdan & Porath, 1985a; Hemdan & Porath, 1985b; Zhao et al., 1991).

 

Polyhistidine-tag 정제
Histidine은 특정 금속에 매우 선택적으로 결합을 하여 IMAC에 널리 활용되고 있다.
특정 조건에서 2-3개의 histidine만이 전이 금속에 결합할 수 있지만, 6개의 histidine은 guanidinium과 같은 강한 변성제의 존재 하에서 전이 금속에 안정적으로 결합한다 (Hochuli et al., 1987). 이러한 단백질 tag을 일반적으로 6xHis tag라고 하며, 이러한 tag은 IMAC resin과의 결합에 유리한 특성을 가져 단백질 정제에 활용할 수 있다.
이때 TALON^® resin을 사용하면 타 IMAC resin 대비 높은 친화도와 특이성으로 고순도 단백질을 정제할 수 있다 (그림 2).

 

그림 2. Polyhistidine-tagged 단백질에 대해 더 높은 친화도와 특이성을 갖는 Cobalt 이온. 각 metal ion을 TALON^®의 고유한 tetradentate chelator를 사용하여 Sepharose^® CL-6B (GE Healthcare)에 고정시켰다. 각 resin으로부터 얻은 20 ㎕의 용출액을 12% polyacrylamide gel에 전기영동하고 coomassie blue로 염색한 결과이다.

TALON^® resin 특징

Cobalt가 포함된 반응성 코어
TALON^®은 polyhistidine-tag 단백질에 대해 높은 친화도 및 특이성을 갖는다 (그림 3). 특히 Cobalt가 포함되어있는 reactive core는 histidine의 공간적 포지셔닝에 매우 엄격하다. 따라서, reactive core의 cobalt에는 인접한 histidine 또는 특별히 포지셔닝된 histidine만이 결합할 수 있다. 반면 nickel-based resin (e.g. Ni-NTA resin)에서는 이러한 조건이 덜 엄격하며 단백질의 polyhistidine-tag 이외의 위치에 있는 histidine과 결합할 수 있어 상대적으로 특이성이 낮다 (그림 3).

 

균일한 matrix
Cobalt-based resin은 nickel-based resin보다 더 균일한 구조를 가지고 있어 금속 이온을 더욱 단단히 고정한다. TALON^® resin의 모든 반응 부위는 그림 1과 같이 3차원 포켓 구조를 보인다. 이러한 포켓들에서 cobalt는 3개의 카르복실기와 1개의 질소 원자에 결합하고, 2개의 다른 리간드, 즉 2개의 histidine에 결합할 수 있다. 이 결합에서 cobalt는 매우 단단히 결합되어 resin 밖으로 누출되지 않는다. Nickel 기반 resin은 nickel 이온이 2개의 다른 배위 구조를 형성할 수 있기 때문에 구조가 덜 균질하다. 그 중 하나는 TALON^®과 유사한 3차원 포켓이고, 다른 하나의 구조는 평면형이다. 이러한 왜곡된 평면형 구조에서 nickel은 2개의 카르복실기와 1개의 질소 원자에만 결합된다. 이 결합이 cobalt에 비해 강하지 않기 때문에, 평면형 반응성 코어는 nickel 이온을 매우 단단히 고정할 수 없어, resin으로부터 nickel 이온의 누출로 이어질 수 있다.

고순도 정제를 위한 Cobalt 기반의 TALON^® Metal Affinity Resin

Ni-NTA resin과의 비교
TALON^®은 nickel IMAC resin과 비교할 때 미묘하면서도 중요한 특성 차이를 나타낸다. 예를 들어, nickel-based IMAC resin은 종종 원치않는 숙주 단백질의 노출된 histidine 잔기와 결합하여 순도를 떨어뜨리는 경향이 있다 (Kasher et al., 1993). 이와 대조적으로, TALON^® 은 nickel-based resin에 비해 높은 선택성으로 polyhistidine-tag 단백질과 결합하고, 숙주 단백질에는 결합하지 않는 특징이 있다 (Sulkowski, 1989). 이러한 특성은 두 가지 실용적인 장점을 제공한다. 첫째, 샘플을 적용할 때 사실상 background 단백질이 TALON^®에 결합되지 않으며, 결과적으로 단백질 용출 전에 번거로운 washing 단계를 생략할 수 있다. 둘째, polyhistidine-tag 단백질을 덜 엄격한 조건, 즉 중성 pH에 더 가깝거나 낮은 imidazole 농도에서도 TALON^®으로부터 elution이 가능하다. Elution은 imidazole nitrogen (pKa 5.97)이 양성자화되어 고정된 이온과의 배위 결합을 방해할 때 발생한다. 또는 imidazole이 구조적으로 histidine 곁사슬 (side chain)과 동일하고 resin 결합에서 histidine을 능가하기 때문에 elution buffer에 간단히 imidazole을 추가해 결합된 polyhistidine-tag 단백질을 경쟁적으로 용출할 수 있다.

 

금속 누출이 단백질 정제에 악영향을 미치는 이유
단백질 정제 과정에서 금속이 정제 resin의 킬레이트 코어 (chelating core)에서 분리되어 컬럼 아래로 흘러 내려가는 경우가 있는데, 이를 금속 누출이라고 한다. 이런 현상이 발생하면 컬럼에서 단백질이 결합할 수 있는 반응성 부위의 수가 줄어 정제된 단백질의 수득량을 줄인다. 또한 유리된 금속 이온은 단백질 활성에도 해로운 영향을 미친다. Resin에서는 모든 금속이 누출될 수 있지만, nickel은 cobalt보다 더 쉽게 누출되는 경향이 있다. 또한 nickel은 염교 (salt bridges)를 형성하여 단백질을 침전시킬 수 있고, 세포와 조직에 독성이 있을 수 있으며, 친핵성 (nucleophilic) 특성 때문에 정제된 단백질을 손상시킬 수 있다. 이러한 이유로 TALON® resin은 킬레이트 코어 (chelating core)에 nickel 대신 cobalt를 적용하였다.