• Laminin-511 E8 fragment 재조합 단백질로, 유래에 따라 제품 선택 가능
• Human iPSC, ESC의 feeder-free culture 시 최적
  - Pre-coating method 혹은 pre-mixing method 선택 적용 가능 (protocol 제공)
• Single cell passaging - 낮은 seeding density의 single cell으로부터 clone 형성 시 효과적
• Passaging 시를 제외하고, 배양 배지 교체 시 ROCK inhibitor 불필요
• iMatrix Calculator 지원

제품설명

Laminin-511 isoform은 세포의 α6β1 integrin과 결합하면서 human PSC (Pluripotent Stem cell)의 성장과 유지에 도움을 준다. iMatrix-511은 사람 다능성 줄기 세포를 장기간 배양 유지한다고 보고된 laminin-511의 활성 부위인 E8 fragment로 구성되어 있으며, 이를 coating제로 사용하면 hiPSC, hESC와 culture ware 간의 접착성을 높여 pluripotency를 유지하면서도 효율적으로 세포를 증식시킬 수 있다 (그림 1, 2).

iMatrix-511은 CHO-S 세포 유래의 iMatrix-511과 유전자 재조합 누에 나방 고치 유래의 iMatrix-511 silk 중 선택할 수 있다. 일반적으로 hPSC 코팅 시 사용되는 mouse feeder cell이나 Matrigel (laminin-111 포함) 등의 경우, 동물 유래의 물질이 혼입되거나 lot 별로 오차가 발생할 수 있는 반면, iMatrix는 고순도의 laminin으로 구성되어 이로 인한 영향을 최소화 할 수 있다.

iMatrix로 배양된 세포는 monolayer형태로 confluency한 성장을 보이며, 낮은 seeding density의 single cell에 적용했을 때 높은 효율로 clone을 형성할 수 있다 (그림 3).


그림 1. iMatrix-511을 코팅한 dish에서 3회 계대한 iPS세포 (253G1)에 대해 다양한 분화/미분화 표지 검출 항체를 이용해 분화 상태를 확인하였다. iMatrix-511에 의한 배양은 Matrigel과 마찬가지로 iPS세포를 미분화 상태로 유지하고 있음을 확인하였다.


그림 2.iMatrix-511로 코팅된 plate에서 253G1 human iPS cell line을 배양한 후 (A, B) flow cytometry 분석 (pluripotency marker SSEA4, OCT3/4) 과 (C) karyotype 분석을 진행하였으며, 약 10번의 계대 배양 후에도 pluripotency와 karyotype 가 잘 유지되고 있음을 확인하였다.


그림 3. iMatrix-511로 코팅된 plate에서 201B7 human iPS cell line을 낮은 seeding density로 single cell로 passaging한 후 7일간 관찰한 결과, 다수의 clone을 형성하면서 monolayer로 점차 배양됨을 확인하였다.

Culture protocol

iMatrix-511은 기존의 feeder cell layering과 유사하게 plate에 pre-coating한 후 세포를 배양하는 방식과 iMatrix를 세포와 pre-mixing하여 배양하는 방식에 모두 적용할 수 있다 (그림 4). 두 방법을 이용한 배양에서 거의 동등한 배양 효율을 확인했으며, pre-mixing method를 사용했을 때에도 기존 방법으로 배양한 세포와 동일한 morphology를 보였다 (그림 5). 자세한 실험 과정은 제품 매뉴얼에서 확인할 수 있다.

** 단, 최적의 coating density는 세포 종류, 배양 배지, 목적에 따라 다를 수 있으며, 필요 시 직접 최적화된 농도를 검토할 것을 추천합니다.


그림 4. iMatrix-511을 이용한 세포 배양 방법 (Pre-coating method, pre-mixing method)


그림 5. 세포 배양 방식에 따른 배양 효율 및 morphology
(A) Pre-coating method와 pre-mixing method를 이용해 배양된 각 hiPSC의 일자 별 세포 수
(B) Pre-mixing method를 이용해 배양된 hiPSC의 일자 별 morphology (48, 72, 96 시간 배양 후)

Laminin-511 E8 fragment의 특징

Laminin은 분자량이 약 800,000 정도인 heterotrimeric membrane protein으로, α/β/γ chain의 구성에 따라 최소 12개의 isoform으로 나뉜다. 각 chain 구성에 따른 laminin의 종류는 세포 종류에 따라 달라질 수 있고, 특히 α chain은 cell-type specific하게 나타난다.
그 중 Laminin-511은 α5, β1, γ1 chain의 구조를 가지는 isoform으로, α5 chain은 초기 배아에서 삼배엽 (ectoderm, mesoderm, endoderm)으로 분화할 수 있도록 발현된다는 것이 확인되었다. 이러한 Laminin-511은 ESC와 iPSC에서 발현하는 α6β1 integrin을 비롯한 범용적인 integrin에서 binding 효율이 높아, 세포를 효과적으로 확대 배양 및 유지할 수 있다.

Laminin-511 E8 fragment는 이러한 laminin-511의 integrin 친화성을 그대로 가지는 활성 부위로, laminin-511을 그대로 활용하는 것보다 human PSC의 부착과 확대 배양 효율이 높을 뿐 아니라 재조합 단백질 생산이 용이해 large-scale에도 손쉽게 적용할 수 있다는 것이 특징이다 (그림 6).


그림 6. Laminin-511 E8 fragment의 특징
(A) Laminin-511과 활성부위인 E8 fragment의 구조
(B) Intact laminin-511과 E8 fragment가 가지는 α6β1 integrin의 binding activity 비교
(C) Matrigel, intact laminin-511, laminin-511 E8 fragment의 각 coating 농도에서 adherent cell 수를 통한 coating 효율 비교

표 1. iMatrix-511, iMatrix-511 silk 제품별 특징

제품별 특징