• 가스 투과성 용기 (G-Rex^® Bioreactor 시리즈) application 추가, 빠르고 편리한 transduction 및 T-cell expansion 가능
• 기존 RetroNectin^® (Code T100A)과 성능은 그대로 (동일한 프로토콜) 가격은 다운
• Lentivirus와 Retrovirus의 Transduction 촉진
• Naive T-cell 비율이 높은 확대배양 프로토콜

제품설명

RetroNectin^® Pro (Recombinant Human Fibronectin Fragment)는 human fibronectin의 재조합 단백질*로 세가지의 domain (cell binding domain; C-domain / heparin binding domain; H-domain, CS-1 domain)을 포함하고 있다 (그림 1). Lentivirus 및 Retrovirus의 transduction시 사용하면 VLA-4 또는 VLA-5를 발현하는 세포가 각각 CS-1 domain과 C-domain (RGDS 서열)에 부착되며, 바이러스가 H-domain에 결합된다. 이때 바이러스와 목적 세포의 물리적 거리가 최소화되는 원리로 transduction이 촉진된다.
또한 T-cell의 확대배양시 interleukin 2 (IL-2)의 존재 하에서 Anti-CD3 mAb GMP grade (Code T210)와 함께 사용하면 T-cell을 자극해 naive T-cell을 고효율로 확대배양할 수 있다.

*분자량: 62,617 Da (아미노산 서열 기준)

그림 1. Fibronectin과 RetroNectin^®의 구조 및 유전자 전달 모델 다이어그램

가스투과성 배양 용기 (G-Rex 24 well plate)를 사용하여 T-cell로 유전자 전달 및 확대배양

가스 투과성 배양 용기 (G-Rex^® Bioreactor 시리즈)는 고밀도 배양이 가능하여 세포의 확대배양에 자주 사용되는 시스템이다. 이때 lentivirus 등으로 T-cell에 유전자를 전달하는 경우, 아래 그림2와 같이 plate 등에서 T-cell의 activation 부터 유전자 전달 까지의 과정을 진행하고 세포를 G-Rex로 옮겨서 확대배양한다 (참고문헌 참조). 본 연구에서는 위의 방법 대신 RetroNectin^® Pro와 anti-CD3 항체를 G-Rex vessel에 직접 코팅하고, 코팅한 G-Rex vessel에서 유전자 전달 및 증식 배양을 진행하여 naive T cell의 유전자 전달 효율 및 증식 효과를 검증했다.

참고문헌:
Mapping variant effects on anti-tumor hallmarks of primary human T cells with base-editing screens
Zachary H.Walsh, Parin Shah, Neeharika Kothapalli, et al., Nature Biotechnology (2024)

그림 2. G-Rex 24 well plate의 유전자 전달 및 확대배양 방법

RetroNectin^®을 사용하지 않은 경우의 비교 테스트

- 실험 조건

실험 조건	A	B
Plate의 코팅	RetroNectin® Pro와 Anti-CD3 mAb GMP grade (#T210)를 4℃에서 O/N동안 코팅한 후 잔여물 제거 및 세척	-
T-cell activation		CD3/CD28 bead 사용
세포	CD8 positive 및 CD4 양성 T 세포
cell 수	1×106 cells
배양 부피	1.0 ㎖
Transduction 시작 시점	배양 시작일 (Day 0)
Lentivirus	CD19-CAR 유전자를 전달하는 Lentivirus를 MOI 5와 15로 감염
배양 배지	LymphoONE® T-Cell Expansion Xeno-Free Medium, 1L Bottle (Code WK552S)에 human serum albumin과 IL-2를 첨가

- 결과

그림 3. T-cell expansion 후 cell 수
10일 동안 배양 후 세포 1 well (2 cm)² 당 cell 수이다. G-Rex 시스템을 사용하면 A와 B 방법 모두 고밀도로 배양 (2x10⁷ cell/cm² 이상)할 수 있음을 확인했다.


그림 4. 유전자 전달 효율
Transduction 후 4일차와 10일차에 테스트한 세포의 CAR 발현율을 분석했다. 그 결과, RetroNection^® Pro 조건 (A)에서 더욱 높은 발현율을 보였고 CAR 발현율이 높은 세포가 얻어지는 것을 확인했다.

그림 5. Transduction 후 naive T-cell 비율
Transduction후 10일차에 naive T-cell의 비율을 분석했다. 그 결과, CD8+CAR+ 및 CD4+CAR+ 세포의 naive T-cell 비율이 MOI (15 또는 5)와 관계없이 RetroNectin^® Pro 처리조건 (A)에서 더 높은 것을 확인했다.

위의 세가지의 데이터를 통해 G-Rex에 RetroNectin^® Pro 와 anti-CD3 항체를 코팅함으로써 바이러스에 의한 유전자 전달과 이후의 T-cell의 확대배양을 동시에 진행할 수 있고, 높은 transduction 효율과 다량의 naive T-cell을 확보할 수 있음을 알 수 있다.

G-Rex는 필요시 간단하게 scale-up이 가능한 시스템이므로 RetroNectin^®을 같이 사용하면 작업 효율을 크게 향상시켜 “cost effective”한 실험을 진행할 수 있을 것으로 기대한다.

형상

보존 -20℃

기원

농도 1 ㎎/㎖

분자량 62,617 Da (amino acid sequence)

순도 >90% by HPLC

사용상의 주의

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