• Tat-independent한 3세대 Lentivirus packaging system
  - HIV-1 유래의 서열을 최소화하여 사용 안전성 향상, 임상 연구에 최적
  - 5’ LTR U3 부위가 CMV promoter로 대체되어, tat trans-activator 없이도 virus 생산 가능
  - 3’ LTR 일부 결손으로 self-inactivation (SIN) 되어, 바이러스 자가 복제 방지
• 높은 역가 (titer)의 virus 생산을 위해 최적화된 패키징 프로토콜
• 실험에 따른 다양한 expression vector 선택
  - 목적 유전자에 따른 최적의 promoter 선택 가능
  (1) Promoter 선택 (MSCV, MSCV-EI, EF1α)
  (2) 형광 단백질 유무 선택 (ZsGreen1)

제품 설명

LVpro Packaging Mix는 여러 개의 packaging plasmid (env, gag, pol, rev 발현)가 premix 형태로 제공하며, 연구자가 실험 조건 최적화 및 셋팅 과정을 거치지 않고도 높은 역가의 Lentivirus를 생산할 수 있다. 본 제품은 HIV-1 유래의 tat 서열을 제거하고 5’ LTR의 U3 부위는 CMV promoter로 대체하여 tat-independent한 lentivirus를 생산할 수 있는 pLVpro lentiviral vector plasmid을 packaging cell에 co-transfection하는 것으로 실험을 진행한다. pLVpro lentiviral vector plasmid와 LVpro Packaging Mix를 사용해 생산된 바이러스는 HIV-1 유래의 Gag, Pol, Rev 단백질과 VSV-G envelope을 발현한다.

그림 1. Lentivirus 생산 workflow



바이러스 제작을 위한 transfection 시에는 보다 높은 역가의 바이러스를 생산하도록 구축된 Lenti-X™ 293T Cell Line (Code 632180)과 functional한 바이러스 생산 효율을 높여주는 TransIT^®-VirusGEN™ Transfection Reagent (Code MIR 6700)을 추천한다.

바이러스 생산 효율을 비교하기 위해, A사의 packaging plasmid와 transfection 시약, 당사의 LVpro Packaging Mix (Code 6195)와 추천 시약 TransIT^®-VirusGEN^® Transfection Reagent (Code MIR 6700)을 사용하였다. 그 결과, 당사 시스템을 이용했을 때 가장 높은 생산 역가를 보였다.

표1. 타사 packaging system과의 생산 효율 비교를 위한 실험 디자인
* Company A’s vector는 CMV promoter 하류에서 ZsGreen1 발현



그림1. LVpro Packaging Mix (Code 6195)와 타사 제품 간의 바이러스 생산 효율 비교
HT-1080 세포에서 테스트한 결과, 타사의 packaging 시스템을 이용한 1번 실험 군 대비 당사 packaging 시스템을 사용한 4번 실험 군이 10배 이상의 높은 생산 효율을 보였다.

Expression vector 구조

- SIN 5‘LTR: CMV promoter hybrid 5’ LTR (U3 free, tat independent)
- Lentivirus packaging signal (Ψ)
- Minimal gag sequence
- RRE (Rev response element)
- cPPT/CTS (central polypurine tract/central termination sequence)
- GOI 발현 promoter
   Option 1) MSCV promoter: 목적 유전자가 크거나, 안정적인 바이러스 생산 역가가 요구될 때
   Option 2) MSCV-EI promoter: 크기가 큰 목적 유전자의 과발현을 유도하고자 할 때
   (Human EF1α 유전자 유래의 exon, intron 서열을 MSCV-U3 promoter 하류에서 발현)
   (단, 목적 유전자의 크기와 서열에 따라, MSCV promoter에 비해 생산 역가가 낮을 수 있음)
   Option 3) EF1α promoter: 목적 유전자의 과발현을 유도하고자 할 때
- WPRE (woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element): X protein이 낮게 발현하도록 개량되어, transduction된 목적 세포에서의 tumorigenesis 유발 확률 감소
- SIN 3‘LTR (U3 free)

* Vector map을 클릭하면, vector sequence fasta 파일 (txt. 확장자)를 확인할 수 있습니다.

MSCV promoter
pLVpro-MSCV Vector (#6962 구성품)	pLVpro-MSCV-ZsGreen1 Vector (#6965 구성품)
MSCV-EI promoter
pLVpro-MSCV-EI Vector (#6963 구성품)	pLVpro-MSCV-EF1-ZsGreen1 Vector (#6966 구성품)
EF1α promoter
pLVpro-EF1 α Vector (#6964 구성품)	pLVpro-EF1 α -ZsGreen1 Vector (#6967 구성품)