- Helper virus를 사용하지 않고 안전하게 Cre-Recombinase 유전자를 탑재한 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6를 제작
- loxP 의존적인 recombinase인 Cre 유전자를 발현하는 AAV를 제작하여 형질전환 마우스 제작 및 각종 스크리닝에 널리 적용
※ 본 제품은 Cloning을 위해 In-Fusion
® 시약을 함께 사용할 수 있으며, 원활한 결과를 얻기 위해
제품 사용 전 In-Fusion® 원리(동영상링크)를 반드시 참고해주시기 바랍니다.
제품 설명
Adeno-Associated Virus(AAV)는 분열하거나 분열하지 않는 세포 모두에 감염시킬 수 있는 non-enveloped의 single stranded DNA virus이다.
AAV는 helper virus가 존재시에만 복제가 가능하면 인간에게는 비병원성이다. 이런 특징으로 다양한 세포에 유전자를 도입하는 유용한 방법이며 유전자치료를
위한 유용한 vector로 사용되고 있다.
AAV는 다양한 혈청형이 존재하고 혈청형에 따라 host나 바이러스의 특징이 다른 것으로 알려져 있다. Serotype 2 (AAV2)는 오래전부터 널리 연구되어
온 serotype으로 다양한 세포를 감염시킬 수 있다. Serotype 1 (AAV1), Serotype 5 (AAV5), Serotype 6 (AAV6)는 보다 조직 감염특이성을 가진 혈청형으로,
AAV1은 근육, 간, 기도, 중추신경계 등에, AAV5 는 중추신경계, 간, 망막 등에, AAV6는 심장, 근육, 간 등에 대한 유전자 도입효율이 높다고 알려져 있다.
다카라에서는 Serotype 1, 2, 5, 6의 AAV vector를 helper virus없이 안전하게 제작하기 위한 AAVpro Helper Free System을 판매하고 있으며,
만들어진 AAV 바이러스 입자를 이용하여 표적 세포나 동물 개체에서 목적 유전자를 일시적으로 발현시킬 수 있다.
본 제품은 loxP 의존적인 recombinase인 Cre 유전자를 탑재한 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6를 helper virus를 사용하지 않고 안전하게 제작하기 위한 제품으로
제작된 AAV-Cre recombinase는 형질전환 마우스 제작과 각종 스크리닝에 널리 사용할 수 있다.
그림 1. AAV2-Cre매개체의 세포주에 대한 유전자 도입
loxP-ZsG을 발현하는 HEK293세포에 AAV2-Cre를 감염시키면 loxP 의존적인 변형이 일어나 stuffer배열이 제외됨으로써 하류의 ZsGreen이 발현한다.
그림 2. AAV2-Cre 에 감염된 HEK293 세포의 FACS 분석
AAVpro®
Purification Kit (AAV2)(Code 6232)를 이용하여 정제한 AAV2-Cre를 loxP-ZsG을 발현하는 HEK293세포에 감염시켰을 때, AAV2-Cre 감염량에 따라 형광을
발하는 HEK293 세포가 증가하였다.
AAVpro® Helper Free System으로 AAV Particle 제작
AAVpro® Helper Free System은 helper virus를 사용하지 않고, 고역가의 AAV를 제작하는 시스템이다. 본 제품에 포함된 3종류의 플라스미드를
AAVpro® 293T Cell Line (Code 632273)에
도입하여 간편하게 AAV입자를 제작할 수 있다.
- pAAV-CRE Recombinase Vector: Cre-Recombinase 유전자와 2개의 ITR을 포함하는 vector plasmid
- pRC Vector: AAV2의 Rep 유전자와 각 serotype의 Cap 유전자를 포함하한 packaging plasmid
- pHelper: AAV를 생산하기 위해 필요한 adenovirus E2A, E4와 VA 유전자를 포함하는 packaging plasmid
기존에 동결/융해법 또는 초음파 파쇄법이 아닌 다카라에서 독자적으로 개발한 AAVpro® Extraction Solution을 이용하면 AAV producing
cell로부터 숙주단백질이나 핵산의 혼입을 최소화하며, 간편하게 AAV vector입자를 추출할 수 있다. 추출시약은 System 제품내에 포함되어 있으며, AAVpro® Extraction Solution
(Code 6235)으로도 판매하고 있다.
또한 고효율의 in vivo 유전자 도입을 위한 AAV 정제에는 AAVpro® Purification Kit (All Serotype) (Code 6666) 또는 AAVpro® Purification Kit (AAV2)(Code 6232)를 이용할 수 있다.
그림 3. AAVpro® Helper Free System에 의한 AAV 제작
내용
AAVpro® Helper Free System (AAV2-CRE Recombinase) (Code 6652)
| 1 |
pAAV-CRE Recombinase Vector (1 ㎍/㎕) |
20 ㎕ |
2 |
pRC2-mi342 Vector (1 ㎍/㎕) *1 |
20 ㎕ |
3 |
pHelper Vector (1 ㎍/㎕) |
20 ㎕ |
4 |
AAV Extraction Solution A |
1.5 ㎖ × 3 |
5 |
AAV Extraction Solution B |
150 ㎕ × 3 |
*1 AAVpro® Helper Free System (AAV1-CRE Recombinase) (Code 6668)에는 pRC1 Vector가 포함되어 있다.
*1 AAVpro® Helper Free System (AAV5-CRE Recombinase) (Code 6653)에는 pRC5 Vector가 포함되어 있다.
*1 AAVpro® Helper Free System (AAV6-CRE Recombinase) (Code 6654)에는 pRC6 Vector가 포함되어 있다.
보존 -20 ℃
단, AAV Extraction Solution A및 AAV Extraction Solution B는 융해 후, 실온 저장
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